2023年2月23日，电子学院王爱民课题组在Nature Methods在线发表文章“Miniature three-photon microscopy maximized for scattered fluorescence collection”。文中报道了重量仅为2.17克的微型化三光子显微镜（图1），首次实现对自由行为小鼠的大脑全皮层和海马神经元功能成像，为揭示大脑深部结构中的神经机制开启了新的研究范式。
解析脑连接图谱和功能动态图谱是我国和世界多国脑计划的一个重点研究方向，为此需要打造自由运动动物佩戴式显微成像类研究工具。2017年，王爱民课题组作为共同通讯作者在Nature Methods发表了2.2克微型化双光子显微镜，获取了小鼠在自由行为过程中大脑皮层神经元和神经突触活动的动态图像。2018年，王爱民课题组又发明了一种基于贝赛尔光束的新型三光子显微镜，成功实现针对稀疏标记的样本进行快速深层活体三维脑成像的研究。
此次，微型化三光子显微镜融合了之前微型化双光子和台式三光子的各自优势特性，一举突破了显微镜的成像深度极限：激发光路可以穿透整个小鼠大脑皮层和胼胝体，实现对小鼠海马CA1亚区的直接观测记录（图2，Video 1-2），神经元钙信号最大成像深度可达1.2 mm，血管成像深度可达1.4 mm。另外，海马钙信号成像所需激光功率小于50mW，大大低于组织损伤的安全阈值。因此，该款微型三光子显微镜可以长时间不间断连续观测神经元功能活动，而不产生明显的光漂白与光损伤。
图1 小鼠佩戴微型化三光子显微镜实景及光学设计图
海马体位于皮层和胼胝体下面，在短期记忆到长期记忆的巩固、空间记忆和情绪编码等方面起重要作用。啮齿类动物海马距离脑表面深度大于一个毫米。由于大脑组织，特别是胼胝体，具有对光高散射光学特性，所以，突破成像深度极限是神经科学家面临的巨大挑战。此次微型化三光子显微镜成像深度获得重大突破，主要得益于全新的光学构型带来的成倍提升的荧光收集效率。引入的微型阿贝聚光镜与简化的无限远物镜密接可以提高散射光的通透效率。同时，阿贝聚光镜与激发光路中的微型管镜部分复用，进一步简化结构及降低损耗。
图2 微型三光子显微成像记录小鼠大脑皮层L1-L6和海马CA1的结构和功能动态。CC：胼胝体。绿色代表GCaMP6s标记的神经元荧光钙信号，洋红色代表硬脑膜、微血管和脑白质界面的三次谐波信号
北京大学赵春竹博士后、陈诗源博士研究生、张立风研究员为该论文的共同第一作者，北京大学电子学院王爱民副教授、未来技术学院程和平教授、赵春竹博士后为论文的共同通讯作者。
